同学： 因为Ch17共笔後半部份没有收录进来，所以内容po在板上，请见谅！ ---------------------------------------------------------------------------- p.43 NCBI:国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，简称 NCBI)是美国国家医学图书馆(NLM)的一部分(该图书馆是美国国家卫生研究所的一部分)。 NCBI位於马里兰州的贝塞斯达，建立於1988年。NCBI保管GenBank的基因测序数据和 Medline的生物医学研究论文索引。所有的这些资料库都可以通过Entrez搜索引擎搜寻。 NCBI的主要服务项目有，基因序列的“注册”、搜寻、比对，以及着名的整合性资料库搜 寻系统Entrez,除此之外NCBI也开始提供蛋白质三级结构的服务。 Physical map p.45上 Physical map是人们为了更进一步提升基因图谱的解析度，而发展出的第三种基因分析法 ，与第二种方法(genetic recombination)不同的是，Physical map以人工的方法对基因 做处理，并不像以往只用天然的工具(Ex:PCR)，因而可以将基因切割成更小的片段，让解 析度大幅的提高。(由原先的1mega bp提高到72K bp) Radiation hybrid and STS markers p.46 STS(sequence-tagged site)是人类基因以人工方式(通常为辐射线)，所切割出具有独特 性的DNA片段。(长度约200-500base pair) p.47 在制作完成後，STS即被放置入囓齿鼠类的细胞(其基因为完整的)中，进行基因的融合， 以利於之後更进一步的分析，此种方法即称为radiation hybrid(RH)。 ++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ (对照第47页的上下两张ppt) ++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ 打断的细胞有个现象：2个marker愈近愈不容易被X-ray打断，愈容易同时出现 Radiation hybrid map p.48 就如同crossing-over(互换)一样，两个基因距离越位接近，被辐射线打断的机会就越小 ，这样的结果产生了不同型式的片段，在与其他细胞融合後，我们就可以检验在细胞中所 含的STS种类，以出现的频率判断两基因的相对距离，藉此拼凑出完整的基因图谱。 p.48下 可调整辐射剂量，来决定STS被切割的长度。 X-ray能量越高→打得愈碎→解析度愈高 p.49上 各种不同的radiation hybrid map。 p.49下-P.54 一般而言，基因图谱并不会仅以一种方法进行分析，而是多种方法相互的配合，以清楚得 确定基因所在的位置资讯，有利於我们对基因资料的处理。 Physical map整理 分析策略:Physical map 种类：(1)chromosomal or cytogenetic maps (2)radiation map (3)sequence map 分析方法：Radiation hybrid、STS markers 解析度：约72K bp p.55下 什麽是“BAC” ●细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome)─从某些外来基因体中取出的巨 大片段(平均15万硷基对(kbp))，再细菌里繁殖。 p.56上 下图对於图谱做一番整合： ++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ (对照第59页上面那张ppt) ++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ p.56下 使用序列标志点(STS，sequence-tagged site)让重叠的复制体有规律 ●为了产生定序(sequencing)的标记，基因图谱(genetic map)和物理图谱(physical map)被制作了出来 ●一个完整的基因库应该要产生能指出染色体中复制片段的规律的完整连续图谱(contig map) p.58下 DNA定序 ●化学定序 ─Maxam-Gilbert定序 ●链末端终止法(chain termination method) ─Sanger定序 ─染料终止子序列(dye terminator sequencing) ●大规模的定序策略(large-scale sequencing strategies) ─引子逐步定序(primer walking sequencing) ─散弹枪定序(shotgun seguencing) p.59上 自动化DNA定序 ●Sanger定序法：1974年由Frederick Sanger研发出的基础链末端终止法。此法造成所有 可能的单股DNA分子和给定的模板互相配对，并且从共同的五碳端开始。 p.59下 Sanger定序法 ●Sanger的DNA定序法包含一次又一次的复制DNA片段，每次都会藉由合并三磷酸双去氧核 苷酸(dideoxynucleotide triphosphate)(并非一般的三磷酸去氧核甘酸)提早终止复制序 列。 ●三磷酸双去氧核苷酸在三碳端(3-carbon position)fm, 缺少一个-OH基并无法在三碳端 上再增加其他的核苷酸，因此妨碍了进一步的DNA合成。 测序过程需要先做一个PCR反应。PCR过程中，双脱氧核醣核酸(dideoxynucleoside triphosphate)可能随机的被加入到正在合成中的DNA片段里。由於双脱氧核醣核酸多脱了 一个氧原子，一旦它被加入到DNA链上，这个DNA链就不能继续增加长度。最终的结果是获 得所有可能获得的、不同长度的DNA片段。 p.60上 自动化定序法 ●依然使用Sanger的链末端终止法，但是更准确并且更快速。80年代和90年代许多重要的 进展提供了此法的可行性。 ●这些新的定序大大地增加定序的速度，让基因体(genome)规模定序成真。 p.60下 基因体学(genomics) ●基因体定序 ─自动化法使其有可行性。 ─科学家→较少的数据产生(data generation)，较多的数据分析(data analysis)。 p.61下 引子逐步定序(Primer walking sequencing) Primer walking is a very common and effective sequencing strategy. In this procedure a primer designed from a know sequence is used to extend sequence information into a previously unknown region. The new sequence information is used to design the next primer, and the process is continued until the entire sequence of the entire sequence of the region of interest is determined. ﹝弱点﹞ ●需要大量非现成的(custom-made)寡核苷酸(oligunucleotide)引子，花费极大(一个引 子需要美金三至五元)。 ●伴随着所需的合成引子延迟。 p.61下 散弹枪定序(比引子逐步定序更有效率) ●为了组合(assembly)需要引发大量的多余(redundant)DNA序列(一般来说是基因体6至15 倍的大小)。 p.62上 两种定序DNA的方法 ●Top and down法─Hierarchical定序： 首先，先有系统的辨别染色体上的标志序列(mark sequences)，如此一来每一段要定序的 DNA片段都会包含一个标志(图a)。这些最简易标志就是限制酶的切割辨识位。 有些限制酶能够辨别八到十二个特别的DNA硷基对，而不是平常的四至六个硷基对。对於 一个有几百万个硷基对的DNA分子而言，这些特殊识别位并不常见，因此被这类限制酶切 割过的DNA，都变成大型的DNA片段。这些巨大的DNA片段可嵌入特殊载体─bacterial artificial chromosome(人工细菌染色体，简称BAC)中，载体BAC可携带长达二十五万硷 基的DNA，并在细菌体内进行大量的复制，建立基因库(DNA library)。 这些DNA碎片可藉由使用标志序列，被有次序的排列在基因图上。为了要排列这些DNA片段 ，可比较由不同限制酶切割的基因库，如果由两个不同限制酶切割的大DNA拥有相同的标 志，意味着两片段重叠。这个方法整体来说是有效的，但是却很缓慢。 ●Button up法─散弹枪定序： 有别於寻找标志、切割片段、然後定序，所谓的「散弹」采用乱枪打鸟的方法，把DNA随 意的切成小片段，再让超级电脑来决定记号，即找出重叠(overlap)的部分(图b)，接着直 接进行排序的工作。 散弹枪定序法较分级定序法为快。自从精密电脑与超级软体问世之後，让基因定序的工作 更有效率，且校正功能让错误大减。拥有一亿八千万bp的果蝇基因即是利用散弹枪定序法 在一年之内被定序完毕。 +++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ (对照第62页上面那张ppt) +++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ p.63下 人类基因体定序的计画目标 ●辨识(identify)人类DNA中将近20000-25000的基因。 ●终止(determine)组成人类DNA的三十亿化学硷基序列。 ●将此讯息储存(store)在资料库。 ●改善(improve)数据分析的工具。 ●将相关科技转移(transfer)到私人部门。 ●对付(address)计画中可能会产生的伦理的、法律的，以及社会的争议(ELSI)。 p.64上 注解(annotate)人类基因体 ●在三十二亿硷基对中，少於百分之二是编码区(coding region)，其中包含总数21000个 基因。 ●一般一个基因有27000个硷基对。 ●超过百分之五十的基因体是由高度重复序列(highly repetitive sequences)所构成。 ●人类的基因体几乎(99.9％)是相同的。科学家已经画出超过两百万的单一核苷酸多样性 (SNPs,single-nucleotide polymorphisms)─即在少数人群(至少百分之一)里会变异的硷 基。 ●基因并不会被平均分配到基因体中。 ●许多基因的功能依然未知。 ++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ (对照第64页上面的ppt) ++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ p.77上 蛋白质体比基因群组复杂 透过基因序列的解码，我们发现人类的基因只有预测的三分之一，这是因为一个基因能够 传达多於一个的蛋白讯号，交替割让我们找到同一基因转录成mRNA上的外显子，转译後的 修饰也增加了基因能产生的蛋白的形式。因此，所有由有机体制造出来的蛋白质我们称为 蛋白质体(proteome)，远比基因组(genome)来的复杂。许多蛋白少了些肽，有些接上醣类 、有些磷酸化，因此蛋白群组比基因群组复杂，一基因一蛋白理论也因此被推翻。 p.78-80 Single Nucleotide Polymorphism(SNPs) 单核苷酸多型性 请参考讲义图片 by 黄翔 --

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