报告请於下星期四11/17中午12点前交给淑娴 以下为课本内容 遇到细菌名字记得要改成斜体~ 祝大家星期一期中考(?)顺利!!! 实验3 染色的方法(Staining Methods) 细菌非常微小而且透明无色，无法用一般的肉眼观察。为了要研究其性质和监别诊断 ，细菌必须经过染色才能在显微镜底下观察。同时染色方法和镜检也成为研究细菌的一重 要工具。依照目的不同，可将细菌染色的方法分成下列四种： 1. 简单染色法(Simple stain)：染色过程只使用单一试剂，可观察细菌的型态、大小及 排列等。 2. 监别染色法(Differential stain)：使用多种试剂的染色，因细菌对试剂反应不同 ，可将细菌做分类，如革兰氏染色法(Gram stain)、耐酸性染色法(acid-fast stain)等。 3. 特别染色法(Special stain)：利用染色方法突显出细菌的特别结构，如：鞭毛染色 (flagella stain)、荚膜染色(capsule stain)、孢子染色(spore stain)、核染色 (nuclear stain)等。 4. 负染色法(Negative stain)：使用酸性染剂(acidic dye)，如：India ink，negrosin ，不染细菌只染背景(background)。常用於不易染色的细菌，如：螺旋菌(Spirilla)等。 3-1简单染色法(Simple Stain) 一、 目的 练习无菌操作、抹片的制作和进行单一染剂的染色，以观察细菌的外形 (morphological shapes)和排列(arrangement)。 二、 原理 简单染色法只以一种染剂对细菌的抹片做染色。所用的染剂通常是甲基蓝 (methyl blue)、亚甲蓝(methylene blue)、结晶紫(crystal violet)和石碳酸复红 (carbolfuchsin)等带有正电荷(positive charge)的硷性染剂(basic dye)，而细菌 核酸(nucleic acid)和很多细胞壁的成分都带有负电荷(negative charge)，因此染 剂主要是利用正负电荷互相吸引而使染剂颜色染上细菌。 三、 实验材料 1. 细菌的培养：以nutrient agar plate(或broth)培养Escherichia coli， Staphylococcus aureus等24小时内的新鲜培养菌(young culture)。 2. 试剂：methyl blue或methylene blue，香杉油(Cedarwood oil)、二甲苯(xylene)。 3. 仪器：酒精灯、接种还(loop)、显微镜(microscope)、玻片(glass slide)。 四、 实验步骤 1. 玻片的准备：做细菌抹片的玻片必须乾净，首先要除去玻片上的油脂。处理的方法， 可用肥皂和清水擦洗或将玻片直接在火焰上过火2~3次。 2. 抹片的制备：避免制作出太厚和太密的抹片是做好抹片的首要条件。一个好的抹片必 须是乾燥後，形成一白雾状的均匀薄层。抹片制作时，细菌是培养在液态培养基 (liquid medium)或固态培养基(solid medium)中，有不同的操作方法。 (1) 液态培养基：以无菌操作方法，用接种环挑取悬浮菌液至玻片抹开，成为约1公分圆环。 (2) 固态培养基：先挑一滴无菌水在玻片的中央，再用接种环从固态培养基挑取一点点的 菌，在含有一滴水的位置，由中央往外轻而均匀的抹开。 3. 加热固定：除非将抹片固定，否则在染色的过程中，细菌将会被冲洗掉。加热固定的 方法为将玻片直接快速在火焰上过火2~3分钟等待液体蒸发即可(切勿火烤过久，以免破坏 菌体原本结构)。 4. 置1~2滴染剂於抹片处，静置适当时间，约1~3分钟。 5. 开启水龙头的自来水冲洗掉抹片上多余的染剂(由玻片上缘轻轻冲洗至无色即可)。 6. 乾燥(室温下自行风乾或在火焰上过火乾燥)。 7. 镜检，在抹片处滴上香杉油，再利用物镜100x的油镜(oil immersion)观察。 8. 观察完毕，请用二甲苯将100x物镜擦拭乾净。 3-2革兰氏染色法(Gram Stain) 一、 目的 利用革兰氏监别染色法将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。 二、 原理 革兰氏染色的原理，需要四种试剂加至抹片上，第一种试剂以结晶紫 (crystal violet)做初染(primary stain)，初染的功能是使所有细菌染上颜色。第二种 试剂使用媒染剂(mordant)，利用革兰氏碘溶液(Gram's iodine solution)与结晶紫作用 形成不可溶复合物(complex)，以加强染剂染色的能力。第三种试剂是以95%酒精 (95% alcohol)做为脱色剂(decolorizing agent)，因细胞壁结构和成分组成不同，使得 有些初染剂可被脱掉，有些则不可以被脱掉。第四种试剂以番红(safranin)做为对照染 剂(counter stain)，和初染剂呈对比的颜色，当脱色後，若对照染剂不被细菌所吸收， 则仍维持初染剂的颜色，若对照染剂会被细菌所吸收，则呈现对照染剂的颜色。以此方 法可将细菌作分类。 三、 实验材料 1. 细菌的培养：以nutrient agar plate(或broth)培养Escherichia coli， Staphylococcus aureus等24小时内的新鲜培养菌。 2. 试剂：crystal violet，Gram's iodine，95% alcohol和safranin O (或carbolfuchsin)，Cedarwood oil，xylene。 3. 仪器：酒精灯、接种还、显微镜、玻片。 四、 实验步骤 1. 准备乾净的玻片(玻片处理如实验3-1)。 2. 使用灭菌的接种环，制备含有Escherichia coli或Staphylococcus aureus的抹片。 3. 让抹片乾燥，以一般加热固定法固定。 4. 置1~2滴crystal violet於抹片处，静置1分钟。 5. 以自来水冲洗(由玻片上缘轻轻冲洗至无色)。 6. 滴1~2滴Gram's iodine溶液於抹片处，静置1分钟。 7. 以自来水冲洗(由玻片上缘轻轻冲洗至无色)。 8. 以95%酒精或丙酮退色。注意：脱色剂要一滴一滴的加，直至洗出液不再呈现 crystal violet颜色即刻停止，否则过度脱色会获得相反的染色结果。 9. 用水龙头的自来水冲洗(由玻片上缘轻轻冲洗至无色)。 10. 以safranin O做对照染色，静置30~45秒。 11. 用水龙头的自来水冲洗。 12. 乾燥。 13. 镜检，利用物镜100x的油镜观察。 实验报告 3-1简单染色法 结果纪录 1. 画出显微镜下所看到的情形。 2. 叙述所看到的型态(球状、杆状、螺旋状)和排列方式。 菌种: Escherichia coli Staphylococcus aureus 形态: 排列: 没有观察 颜色: 3-2革兰氏染色 结果纪录 1. 画出显微镜下所看到的情形。 2. 叙述所观察到的型态和排列方式。 3. 叙述细菌经染色後的颜色。 4. 区别各染色细菌是属於革兰氏阳性或阴性。 菌种: Escherichia coli Staphylococcus aureus 形态: 排列: 颜色: --

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