作者nidus (咕叽)
看板Biology
标题<求救>lipofectamine 效率
时间Sun Oct 5 22:49:17 2008
请问有人用过吗？？
我做了好几次效率低到看不到想要表现的protein
我的步骤如下：
genaid抽plasmid 再以酒精沈淀进一步纯化
使用细胞为hela
transfect 前一天在六公分盘种9X10五次方细胞
第二天取500λserum free DMEM 与 3μg plasmid混和
20λlipofectamine与500λserum free DMEM混和 等五分钟
将上述两溶液混和 等20分钟
将混合液倒入昨天seeding好的HeLa cell 六公分盘中
HeLa cell 六公分盘会先以PBS wash两次 以将serum洗掉
六小时候再将medium置换成有serum的DMEM
24小时候收细胞 western检测
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plasmid有提高至8μg 结果还是一样
plasmid也有digest後跑胶 位置也对
只不过我欲表现的protein 并不是一个完整的protein
完整序列有276aa 而我只有取1~120
请问有没有可能是无法folding而被进一步degrate掉？？
以上希望有大大相助 任何建议都好
谢谢
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 125.225.133.107
※ nidus:转录至看板 Biotech 10/05 23:30
1F：推 vixen:1.你怎麽抽plasmid的? 2.丢个GFP plasmid做控制组 10/06 12:39
2F：推 abc0:lipofectamine+DMEM与plasmid+DMEM是怎样混合的?请仔细说一下 10/06 12:44
3F：→ nidus:全照genaid protocol抽 10/06 15:40
4F：→ nidus:其实有做过只有EGFP的 结果他有表现 而且还蛮多的 10/06 15:40
5F：推 wchienkai:那看来不是 transfection efficiency 的问题了 10/06 15:55
6F：推 humwang:transfection前是否先把细胞放到antibiotics free medium 10/06 20:32
7F：→ humwang:transfection时是不是在antibiotics free medium? 10/06 20:32