有几个技巧可以试试看 1. 在pcDNA3.1上,你设计的 BamH1和Eco RV中间是否还有其他的enzyme切点 若有 可以再加另一个enzyme去切 可加强有ligation成功的plasmid数量 2. 还有ligation的时候,温度,时间,insert & vector比例和额外的添加剂 都要做交叉测试,一般我们会同时做个4~5组,然後再transform. 3. 在transform的时候也要注意cell和加入的plasmid的比例,另外也可以问 问其他实验室有没有比较新鲜的compment cell. 这个地方测试看看就知道是不是基因本身有问题了~~ 祝好运罗~~ Keivn ※ 引述《[email protected] (煜凯)》之铭言： ※ [本文转录自 Biotech 看板] 作者: kws6874 (煜凯) 看板: Biotech 标题: [求救]molecular cloning 时间: Wed Feb 20 23:56:40 2008 最近经由RT-PCR方式要 clone 一段1480bp的片段到pcDNA3.1(-)的vector上.. .. 确认原先primer已设计Bam HI与Eco RV位置无误外,另外还在尾端多增加7mers作为 提升PCR products digestion efficiency... 可是..藉由37度C最佳buffer作用2小时及纯化後..再以insert:vector > 6的ratio进行 ligation及transformation竟然没长半颗clones...实验所使用的enzyme及competent cells都已再三确认其功效无误... 但试了几次都结果失败... 另外,则是以T-A cloning方式进行cloning... transformation结果是OK...也看到 colonies长出来.. 但经由蓝白筛过滤挑选剩余colonies进行PCR check ..始终没挑到 -- ┌─────◆ＫＫＣＩＴＹ◆─────┐ KKBOX◤歌名╱歌手╱歌词╱专辑◢搜寻 │ bbs.kkcity.com.tw │ ★ http://www.kkbox.com.tw ★ └──《From:59.105.162.159 》──┘ 超过100家唱片公司合法授权 音乐尽情下载 --