※ 引述《[email protected] (uranff)》之铭言： : 现在我想要做一个3kb左右的PCR : 由於之後要接着做cloning，所以比较要求准确性 : 先前试过的几个PCR酵素搭配模式： : pfu DNA polymerase (Promega) only (0.6U in 25ul)（使用期限仅到今年五月） : Blend Taq DNA polymerase (Toyobo) only (0.5U in 25ul) : Viogene Taq DNA polymerase (5U in 25ul) + pfu (同前) (0.6U in 25ul) : （用这种搭配模式的原因是因为有看过paper利用pfu专责做更正） : 使用的template：cDNA （以random primers做RT） : condition：95℃ 5min : 95℃ 1min : 69℃ 1min (35 cycles) 黏合温度太高 可以试着降低一点 我不知道你的incert是有做什麽处里(修饰还怎样的) 但是以我做cloning的小小经验 温度降到58度都可以做出来 还有一般来说 我做pcr若片段长度超过800bp我才会调成1min 不然一般elongation的时间都大致在30-40秒上下 你可以试着调整自己的protocol看看 pcr会夹不出来 除了你忘记加temple.dNTP之外(真的会忘记加 XD) 最重要的就是引子黏合的温度了 : 72℃ 7min : 72℃ 15min : （另外，第一组用pfu的在denature及anneal都拉长到3min，後来听同事意见改短） : 结果只有第一组pfu only有跑出一条700bp左右的band，其他两组完全跑不出来 : 这样子的话，我要从哪一方面着手改，才能够跑得出来呢？ : 我一个同学有跟我说过，他们那边用Merck的pfu DNA polymerase，可以很轻松的跑到12kb : 难道真的要换Taq来做才做的出来吗？ : 谢谢 -- -- ╭──── Origin:<不良牛牧场> bbs.badcow.com.tw (210.200.247.200)─────╮ │ ↘ Welcome to SimFarm BBS -- From : [125.232.209.42] │ ╰◣◣◢ ◢◢《不良牛免费拨接→电话:40586000→帐号:zoo→密码:zoo》 ◣◣◢ ─╯