※ 引述《ginmol (储备博士)》之铭言： : 我有几个有关western blot的问题想请教各位先进： : 1. 一级抗体的稀释溶液何种较佳？可使其能够保存重复使用？ 以Santa Cruz p53 DO-1 antibody为例, 我将ab 1:3000 泡在 1X TBST with 0.05% Sodium Azide, 可加 4%奶粉. 存放及使用都是在4度C. 这一管东西, 我平均一个礼拜用一次以上, 回收再用. 再没有补加ab的情况下, 目前已经迈向第三个月了. 效果依旧很利. 要注意的是一抗跟二抗之间的wash要充分, 例如 1X TBST 15 min X 4 time. 把Sodium Azide 充份洗去, 因为这东西好像会影响二抗HRP的活性. : 2. 是否曾尝试以微量反应体积覆盖membrane的方式进行抗体抗原反应？ 我是用小塑胶袋封装membrane, 以mini gel的面积来说, 大约6~8 ml的 ab溶液. 我同学是把membrane 装进 50 ml试管, 也是加 6~8 ml的溶液. 放入摩天轮去转. : 3. 一般蛋白loading量约多少较为适当？ mini-gel, 7.5 mm 厚. 我一般loading从 20 ~ 60 ug, 取决於你想看的protein本身 的量多不多. : 4. AP与HRP系统，何者的讯号强度较高？ 我个人偏好HRP, 虽然较不方便, 但讯息比较敏锐. 如果你用好一点的ECL kit, 讯号会很强. : 感谢各位的回答....... 以上是小弟的经验, 烦请大家指正. 感恩. 也祝大家实验顺利. --

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