看板Biology
标 题Re: [问题] 请问一下transformation的事情
发信站KKCITY (Fri Apr 28 11:36:01 2006)
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※ 引述《[email protected] (.......................)》之铭言：
> 老板叫我做pHIT60这个plasmid的transformation
> 结果做了两礼拜都都没做出来
> 把那个plasmid拿去跑胶check DNA是否正确
> 跑出来的结果也是正确的
> 因为protocol上说这个DNA对competent cell有毒性
> 所以要用JM109这个strain的competent cell
> 後来我也换那个strain来做也做不出来
> 我们老板亲自来做也做不出来
> 所以我想请问这里的前辈们
> 有没有人也用过这个plasmid来做transformation
> 是否可以指点迷津
JM109你用啥培养液去养? 啥温度?
根据Invitrogen的FAQ, CMV promoter在原核生物仍然会有低背景表现,
如果DNA量够多的话(i.e. micro gram等级), 可以找不擅长表现的strain,
(请搜寻Stratagene或Invitrogen, 关键词toxic cloning)
也可以降低温度, 选比较烂的培养液(细菌过太爽的话, 表现蛋白质较佳).
太闲的话, 可以在CMV promoter与後面的gene之间插一段prokaryotic
trascription terminator, 不会影响到在真核细胞的表现, 又可以抑制细菌中的毒性,
可以参看lucigen.com的clonesmart kit的说明书与vector序列.
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