==> uyap (前脚走，後脚放) 提到: 以前跑的经验是同时借别人的primer试及别人的自己的reagent 别人RCR cycle确认自己的reagent有没有问题 如果别人的primer跟别人的reagent也跑不出来 那表示机器有问题或自己pipet有问题，没有校正或不正确 接下来自己的reagent没有问题後 PCR机器及pipet也没问题以後 那就是浓度的问题 plasmid的各种浓度 MgCl2的浓度 是我之前遇到的最主要问题 也许每个人不一样 可以去抓band最亮的浓度 其次是PCR的cycle或温度 之前跑的各种不同cycle是都差不多 不同的cDNA，温度有的会影响 但有文献可查 如果自己的reagent有问题， 别人的reagent没有问题 那就要一个个去抓 看是哪一瓶有问题， 有可能是染污，或者是没有活性 也有可能你的plasmid在prep的过程中有问题 总而言之，就像推理一样一个个去排除 最後就会发现问题，很耗时 做出来也不要高兴 要记得negative control > ==> [email protected] (考完闷的紧) 提到: > > 取菌液 1 c.c. > > 以 10000 xg 离心5分钟 > > 取沉淀 改加入 200ul 无菌水 > > 煮沸 10mins 以 10000 xg 离心 5 mins > > 取上清液後 > > 取 2ul 跑 PCR > > PCR 添加的药剂 > > template 2 ul > > primer 各 1 ul > > 混合溶液 10 ul 内含 > > polymerase 1.25 U > > MgCl2 1.75 mM > > dNTP 200 uM > > buffer <---- 这个产品上面没有写含量或浓度 > > 无菌水　　 36 ul > > 之後以 95度 5 mins 1 cycle > > 95度 30 sec > > 55度 1 mins > > 72度 30 sec 35 cycle > > 最後以 2% agarose 跑电泳 > > 20 ml 的胶 以 5ul 的 ETBr 内染 > > 如果有需要增补的地方 > > 请各位大大告知　谢谢^^ -- Good actions require everyone's cooperation. Let go of personal bias. Give without expectatiion,and give with gratitude. ~Jing Si Aphorisms -- ☆ [Origin:椰林风情] [From: 61-217-193-119.dynamic.hine] [Login: **] [Post: **] -- ☆ [Origin:椰林风情] [From: 61-217-193-119.dynamic.hine] [Login: **] [Post: **]