作者aggaci (好想学钢琴阿!!)
看板Biology
标题Re: 为何我的6xHis-protein在nickel column拉梯度ꐠ…
时间Wed Nov 2 17:18:32 2005
※ 引述《[email protected] (u860427)》之铭言：
: ※ 引述《[email protected] ()》之铭言：
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: > 为何我的6xHis-protein在nickel column拉梯度之初,就被洗出来?
: > 我利用大肠杆菌来表现6xHis-protein,
: > 经过IPTG诱导後,
: > 破菌!
: > 将上清液灌入nickel column,
: > 在wash时, 没事!
: > 但是在0~500 mM imidazole拉梯度（二十倍体积）之初,
: > 我的6xHis-protein 在一开始（一倍体积）体积, 就被洗出来!
: > 所以我的nickel column拉梯度图,
: > 就在最前面只出现了一根很大根的peak!
: > 然後就持平到最後,
: > 经过western blotting分析後才发现,
: > 我的6xHis-protein在前面这根很大根的peak里面,
: > 但是这根很大根的peak里面还伴随着数百种蛋白质,
: > 请问怎麽会这样呀?
: 有几种可能
: 1.你把His tag接在protein的哪一端?
: 在N-ter的话因为它是先被制造出来的,所以很可能folding时被包进去了,造成binding能力不足.建议接在C-ter
: 2.设计时的问题
: 若His tag本身离protein太近也会造成tag无法随意飘动,或幅度太小,建议可於prtein与tag间加上一个cutting site (ex:factor X)反正也方便将纯化後的tag切掉,或者是多接一点His,我一般都用10个His喔
: 3.实验准备上的问题
: 你的column用了多次的话就应该要re-charge,或column中的EDTA或imidazole是否有清洗乾净.再者你的所有buffer是否有会干扰实验的物质,或你的梯度拉的太快,loading时流速过高,都会有所影响喔
: 4.命不好
: 其实做蛋白质实验常常会是听天由命的,表现量,纯化结果等等.基本上本人也发身过许多次.但基本上尽力而为罗
5.charge可以试试钴离子...
binding较强
6.试试GST或是MBP fusion protein吧....
His-tag我觉得不太好用....
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