high background, 在非抗原的蛋白质容易出现反白的情况 简单的例子就是 protein marker 我跑的胶用prestained protein ladder. 5 ul/well 抗体titer是用说明书上建议的 当exposure时间(我用ECL)过长时 marker的部份就会反白 非常清楚 可以检讨high background的原因 blocking solution, incubation time, antibody titer, exposure time... specificity越低的抗体越容易出现high background 抗体浓度越高时亦然 ※ 引述《[email protected] (uranff)》之铭言： : > 这是因为抗体浓度的关系 : > 是不是自己制作的抗体 : > 通常要自己试一下 : > 这样的结果应该是抗体浓度太高 : > 你可以先做一个实验 : > 相同的sample用不同稀释抗体浓度去试 : > 例如 : > 1:10000 : > 1:50000 : > 1:100000 : > 要看你反白的那次抗体浓度用的是多少 自己设计 : > 上面我说的是一抗的浓度 : > 你二抗的浓度就固定调成一抗浓度稀释的五倍 : > 例如一抗 : > 1:10000 : > 那你二抗就调 : > 1:50000 : > 这样做做看 : > 找出一个适合你protein的抗体浓度 : > 不过如果你抗体浓度稀释的真的已经很高很高 : > 我建议要下降你的protein浓度 : > ㄧ般用到1ug/ul就可以了 : > 不用太高 : 我自己是用打兔子得来的血清IgG做Western : 抗体浓度大约是1μg/μl，稀释比例为1：500 : 用这个比例下去做，偶而会有这种band反白的情况 : 可又并非是每次都会这样 : 另外不知道有用自制抗体做过的先进们有没有碰过这个问题 : 我将血清以两次protein G sepharose纯化过 : 纯化出的IgG与买来的抗体相比差不多纯（直接一起跑SDS-PAGE之後染Coomassie blue） : 之後我就一起收在4℃，有加0.05％ sodium azide : 以後就一直拿同一管出来做Western : 可是最近几天的Western做完之後呈色都没有讯号 : 但是换了另外一管（一样收藏在4℃），用一样的稀释比例去做就又做的出来 : 然而之後拿这两管直接去跑SDS-PAGE却又看不出先前我使用的那一管有degrade现象 : 这让我觉得很奇怪，到底我的保存方式是不是不对？请大家指教 --

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