※ 引述《[email protected] (奶酥面包)》之铭言： : 想请教各位高手~~ : 我用bio-rad的NC paper压neutrophil的total p38　（antibody是cell signal） : 压overnight出来只有弱弱的一条band (protein load的量是５０ug) : （用同样的蛋白质量一秒GAPDH就强得不得了） GAPDH本来就是over expression了,所以一秒就很强很正常, 但如果GAPDH有压出来,在transfer後也有看到marker又过去的话, 那代表transfer的过程应该没有问题,protein一定有过去 而且看样子,显影用的reagent也没问题, 看在GAPDH有压出来的份上,暂且就推测在transfer之前所有步骤, 到block结束wash染一抗之前都没问题(不过原PO很多没讲,也不知道有没有问题) 所以如果有问题的话, 或许是antibody的efficency的问题,不然就是真的这个protein本来就是低表现level, 不知道这个实验有没有做positive control,如果没有的话, 老实说,其实也无从比较实验组是真的表现较弱或是antibody efficency不好 : 於是我改用Pall corporation的PVDF 我使用的经验,NC paper做出来的解析度比较高,比较清楚, 虽然PVDF做起来比较不容易破,很好使用,不过用久了个人还是偏好NC paper做出来的data, 而且NC paper比PVDF优越的地方在stripping後,NC paper上的protein维持得比较好, PVDF上的protein在经过stripping後,容易出现坑坑洞洞的 : (PVDF用前先泡一下methanol→用三次水wash一下→泡transfer buffer五分钟。 ~~~~~~~~~~~~~~ 不要用水wash了 PVDF泡methanol可以泡久些,至少要泡到有点半透明的感觉,transfer才会好, 我记得Pall corporation公司的说明书好像有写,泡完methanol後, 要再放在transfer buffer些时间,让membrane适应适应 : 　之後的过程都没有让PVDF乾掉) : 哇～～～结果压出来也是弱弱的一条band : 各位高手帮我想想办法啊～～～ 说不定这个结果是真的呀!说不定他真的本来就该这麽弱 ^_^ -- ╱▎ ╱ ▎ ＿＿ ╱￣￣▎ ☆°．﹒‧°★°．﹒‧°﹒▕智为▏～人生仅是无端虚无梦幻～ ╱︠ nemos～☆°．﹒‧°★°．﹒‧°﹒ ￣￣☆°．﹒～或者了然於天地间～ --

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