作者KLAHA (Scars of sabbath)
看板Biology
标题Re: [问题]关於抽质体DNA的问题
时间Wed Feb 18 14:00:34 2004
※ 引述《cobainH (穿越无限透明的蓝)》之铭言：
: 有个疑问
: 都要破菌了 为何soln 1还要维持菌的完好
: 印象中是为了破菌耶
因为菌的genome DNA是以一端附着於细胞膜上的circular form存在
所以要加入GTE
G=GLUCOSE~等张,避免菌破(书上是用"prevent cells from brusting")
T=Tris~调pH值的buffer
E=EDTA~螯合剂,抓阳离子,使DNAse等无法作用且弱化细胞膜
soln 1还可加lysozyme先弱化细胞膜
不过GTE是非必要的没错,只是习惯...反正有soln 2
soln 1只是弱化菌
加入soln 2时菌才破
: 悬浮是为了能和soln 2 反应完全
: 而且 应该是三种都加了 才离心吧.....???
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我打错了 XD
谢谢~刚更正了
: : 听你说法应该是用alkaline lysis
: : 离下菌,去掉broth
: : soln 1 : GTE
: : 菌的等张液,维持菌的完好
: : 务必使菌完全悬浮
: : 加soln 2：SDS和NaOH
: : SDS=detergent,破菌
: : NaOH=使DNA变性(denature),由双股打开为单股型式
: : 混匀即可,切勿剧烈混合使genome DNA断裂
: : 离心,舍去悬浮(lipid)&沉淀物(protein等),取出液体
: : 内有denature之genome及plasmid DNA
: : 加soln 3：加酸(我用醋酸钾)
: : 中合soln2,务必混合均匀
: : 此时plasmid DNA因片段较短,马上renature
: : 但genome DNA片段较大,不及马上renature
: : 加入100% EtOH沉淀,离心
: : 去除上清液(有genome DNA)
: : 留pellet=plasmid DNA
: : 以70% EtOH wash
: : 乾燥後得plasmid DNA,
: : 溶於适量水或TE buffer内
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在biology版po文真是件傻事......
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※ 编辑: KLAHA 来自: 140.112.234.180 (02/19 13:23)