※ 引述《ophisoka (Hisoka)》之铭言： : 我现在手上有一种未知功能的蛋白质 : 已经有这个蛋白的 KO mice : 老板要我取 wild-type and KO mice 不同器官的RNA跑RT-PCR : 比较相同器官中 WT and KO mice 这个蛋白基因的表现量 : 但跑完後我不清楚数据要如何分析 : 因为没有一个 wt and KO 都可以用的标准值 : (我目前用的算法是把其中一个器官当1 但是KO也这样算好像就不对了 因基准点不一样) : 有没有什麽算法是可以取所有sample的绝对值(control是GAPDH) : 然後可以做出WT and KO 目标基因表达性差异的图 : 还有 我wt 已作3重复，要如何把3次统合起来 : ※ 编辑: ophisoka (140.123.186.178), 11/26/2014 16:47:30 很多人是用你要看的基因，跟GAPDH算出差值 用Relatvie的概念去做Normalization 但我习惯以下方法： 1. 先把GAPDH在sample中的Ct值 放在一起看 是否差不多？ 一般来说Ct值不会差很多，除非你这个蛋白会直接影响到跟cytoskeleton相关的 pathways，若在确定不会影响，还差很多，那就手有问题，要重做..... 2. 利用全部samples的 GAPDH的平均值来算出每一个sample要调整多少值 利如 （由左到右 分别3个WT, 3个KO GAPDH的Ct值): 15 14.5 15.5, 14.5 15.5 15 --> 平均15 scaling: 0 +.5 -.5, +.5 -.5 0 3. 你要看的基因就照这个scaling factor增减 4. 这样子你就不用跟GAPDH去先做一个Relatvie的差值，同时也先检查了你这次手稳不稳 5. 调整好後，把你要看的基因，在WT中的平均Ct值算出来 得到 Mean.WT 把每个sample中的基因Ct值，都去减这个Mean.WT 你可以会得到 +.1 -.2 -.1, +8 +8.3 +7.8 这时候你就要用 2^-(上述数值) (为什麽要代负号知道吧？Ct越高 表达量越低） Ratio: 0.933 1.149 1.072 0.004 0.003 0.004 最後若为3个biological replicate 就是画 mean +- S.E.M, tech. replicate 为S.D 6. 在是biological replicates的情况下，可以再做T-test -- ★ミ ζ ○_. /(╯ 【今晚的天空有一颗流星划过 在预言着什麽】|> --

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