介绍一下找寻 Pseudogene 的软体：PseudoPipe，最近正接触这套软体 ，顺便来做个介绍。︿︿ [前言] PseudoPipe 是 2006 年发表在 Bioinformatics 的软体。它是一个寻 找 pseudogene 的套件。要使用这个套件之前，先得对 pseudogene 有 一个基本的了解，这样对我们使用这个工具来说会比较确切。 [Pseudogene 介绍] 何谓 pseudogene？ Pseudogene，中文也许称作伪基因，是在基因体里 面跟其他某些基因序列非常类似，但是却没有基因表现的伪基因。它 们是怎麽出现的呢？它们的由来是由既有的基因所而来的，分三种方式 。 第一种是称作 processed 或称 retrotransposed （反转录的）。一些 mRNA 在的序列透过了 retrotransposon（注1）（反转录跳跃子），被 插入了基因体。因为是反转录得来的序列，插入基因体之後的序列是 processed mRNA 序列，因此缺乏 intron 以及 poly-Atail。另外也没 有 promoter 序列，因这个伪基因从出现的开始就没有功能。在演化过 程中也没有受到 selection 的压力，因此突变可以持续堆积也不会对 生物体造成影响。这些突变就会造成它跟来源基因的差异，年代久远就 序列相似度就可能越低。 第二种是 non-processed 或称 duplicated pseudogenes。在基因中透 过 homologous recombination 所造成的 duplication event 直接将 基因序列「复制」到基因体的另一处。在复制後，新的基因常常保有跟 旧的基因一样的结构，包含 promoter、intron、exon 等，因此它仍然 是有功能的：仍持续有基因表现。但因为生物体内有两套一模一样的基 因，失去一套也不会有什麽影响，因此有突变亦不会致命，因此久而久 之其中一套基因就可能会失去功能。 第三种是由既有基因直接退化而来，而不先经过基因的复制。也许在演 化的历史中，一个基因不重要了，突变亦不会对生物体造成影响，因此 就累积突变。 不论其来源为何，伪基因基本概念很简单，在演化的历史中，某些基因 没有受到 selection pressure，因此基因即便是突变了，生 物体仍然可以存活。因此这些基因，即使结构仍看起来仍很像真的，或 许仍有 promoter，有 splice site 等，但却没有真正的功能。因为无 基因表现，因此就被称作 pseudogene（伪基因）。（Pseudo：假冒的） [PseudoPipe] 耶鲁大学的 Gerstein 实验室致力於寻找许多基因体里面的伪基因，包 括 2004 年在 Genome Research 所发表的 Ribosomal protein 的伪基 因，以及 2004 年在 Trends in Genetics，发表的老鼠与人类的 pro- cessed-pseudogene。 整个寻找的流程在 2002 年这篇似乎已初具雏型 （本人未细看 XD)，另在 2003 年 Genome Research 中的 Millions of Years of Evolution Preserved: A Comprehensive Catalog of the Processed Pseudogenes in the Human Genome 这篇个人初看之下 个人认为最为详细。 PseudoPipe 软体主要是针对这个流程组织化，并剔除需要人工校正的 步骤，经统整後的 Python 程式。基本运作的流程是，拿已经注解好的 的基因的胺基酸序列当作 query ，透过 tblastn 对基因体做序列比对 （注2）。序列比对完之後会得到一堆相似的序列，包含了 query 自己 。 程式会把片片段段的 tblastn 的结果，整理出一个个相似都高的区 域。这相似度高的区域当然可能是 query 自己本身， 因此透过已经注 解的所有基因位置，来剔除已经注解的区域。得到的片段还不能称作是 伪基因的预测，须再滤掉所谓的 false positive 以及可能的有功能基 因区域。最後才得到预测的伪基因结果。 所谓的 false positives 的依据，伪基因序列必须跟来源基因 （最相 似的）相似度高答 40% 以上，E-value须低於 1E-10，涵盖的长度须是 原基因的 70%。如果没有，就是 false positives。 而有功能的基因区域则是如果序列没有明显的 frame-disruption ，例 如 stop codon 或者是 frameshift 等，且与来源基因(query) 共享有 超过 95% 的序列相似度，且 translate 之後至少涵盖与来源蛋白质长 度的 95%，则被归类於可能有功能的真正基因。这些也不包含在最後的 结果里面。 tblastn 所找到的区域如果不是落在以注解区域的基因内，且不是 false positive 或者是可能的具功能基因，就是所谓的伪基因了。 PseudoPipe 会把结果做几项分类，第一种是 retrotransposed 的伪基 因，这些可以透过缺乏 intron 、poly A tail、并且有 small flanking repeats 得知。第二种是 duplicated 伪基因。第三种是 pseudogene fragments，这些是相似度非常高，但是序列跟来源基因比 较来说太短，可能是其它部份已经突变得太厉害（too decayed）， 因 此无法判断是 retro-transposed 或者是 duplicated。 [先天限制] 这个软体有一些先天限制。第一个是，最先前介绍三种伪基因，第三种 就无法用此软体找到。因为这是由於本来的那个基因就直接因为不重要 而突变掉了。因此在这个物种内就没有相似的来源基因可以作为寻找的 依据。第二，如果某些物种的基因注解就没有做得很详细，因为缺少一 些来源基因，那找出一些伪基因就变得更不可能，更何况你无法剔除 tblastn 结果是座落在别的基因内的可能性。第三是，如果你认为某物 种缺乏你有兴趣的基因序列，想透过跨物种的基因预测所得来的基因， 再进行伪基因搜寻。那个人认为这个流程似乎也有问题，因为你所想 query 的基因本身就是一种预测，既然是预测，其结构也可能是有问题 的。除非是第一类伪基因，仍可能由缺乏 intron 所判断，若是第二类 ，有可能所谓的 pseudogene 就早已涵盖在你的预测当中，且既然已经 是预测，所谓 frame-shift 跟 premature stop codon 就没有意义。 也许你所预测到的基因就是 premature stop codon 的一个伪基因呢！ 因此在做这件事情之前，须考量到你的基因预测是否会把一些可能的伪 基因包含进去。如此，你得到的结果，才是你真正想要得到的结果。 === (注1)：retro- 的 e 请注意发音，包括 retrovirus 等都发 kk 里反 3 的那个符号，跟 IPA 的符号相同： http://en.wikipedia.org/wiki/Open-mid_front_unrounded_vowel (注2)：PseudoPipe 软体内的解说容易让人误以为是使用 blastx。但 其实需要的是 tblastn。据本人透过 email 与作者联络後，得知他们 下的参数范例为： blastall -p tblastn -m 8 -z 3.1e9 -e .1 -d ../dna/dna_rm.fa -i split/0008.fa -o out/0008.out --

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