※ [本文转录自 Biology 看板] 作者: wwwjjj (......) 看板: Biology 标题: [问题]关於抽质体DNA的问题 时间: Mon Feb 16 21:05:24 2004 在下是刚进实验室的新手 目前还是大学生 想请问各位大大 抽plasmid DNA的步骤中 在加入各种buffor,静置.......... 之後有一个步骤:离心後取澄清液 上面的解释说此澄清液含有plasmid DNA 而沉淀物则包含了genomic DNA, proteins, cell debris, SDS ... 我想请问的是genomic DNA不是细菌除了plasmid外的DNA 两者同样是DNA只是大小.形状的不同 为什麽plasmid DNA会溶解而genomic DNA却会沉淀下来 不知道这样形容会不会很模糊 thank you:))) --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 163.25.118.10 作者 palan (燃烧吧!脂肪!) 看板 Biology 标题 Re: [问题]关於抽质体DNA的问题 时间 Mon Feb 16 21:16:22 2004 ─────────────────────────────────────── 我不知道我记的对不对... 好像是在抽DNA的过程中 会使双股的DNA打开成为单股 再令其重新配对 但genomic DNA比较大 所以重新配对回去不易 故沉淀.. 作者 KLAHA (Scars of sabbath) 看板 Biology 标题 Re: [问题]关於抽质体DNA的问题 时间 Tue Feb 17 20:42:55 2004 ─────────────────────────────────────── 听你说法应该是用alkaline lysis 离下菌,去掉broth soln 1 : GTE 菌的等张液,维持菌的完好 务必使菌完全悬浮 加soln 2：SDS和NaOH SDS=detergent,破菌 NaOH=使DNA变性(denature),由双股打开为单股型式 混匀即可,切勿剧烈混合使genome DNA断裂 加soln 3：加酸(我用醋酸钾) 中合soln2,务必混合均匀 此时plasmid DNA因片段较短,马上renature 但genome DNA片段较大,不及马上renature 离心,舍去悬浮(lipid)&沉淀物(protein,genome DNA等),取出液体 加入100% EtOH沉淀,离心 去除上清液(有genome DNA) 留pellet=plasmid DNA 以70% EtOH wash　 乾燥後得plasmid DNA, 溶於适量水或TE buffer内 作者 zerpher (画圈圈..ψ︶︿︶) 看板 Biology 标题 Re: [问题]关於抽质体DNA的问题 时间 Wed Feb 18 01:29:37 2004 ─────────────────────────────────────── 其实这个观念很多老师也这样讲过 我以前也这样认为 直到被一个老师纠正後才知道不对 使用Alkaline Lysis 抽取 plasmid 的原理 是利用在一个小范围的pH(12.0-12.5) 这时候linear DNA会denature 但CCC (covalently closed circular) DNA (就是plasmid)"不会denature" 此时Chromosomal DNA is denatured 当我们将溶液中和以後Chromosomal DNA renature 并且和蛋白等巨分子纠结 然後可以被离心沉淀 这就是plasmid抽取的原理 附上一个网址 里面介绍的还蛮详细的 http://www.sfu.ca/bisc/bisc-429/Monday_29_september.htm 作者 KLAHA (Scars of sabbath) 看板 Biology 标题 Re: [问题]关於抽质体DNA的问题 时间 Wed Feb 18 13:38:36 2004 ─────────────────────────────────────── 我去察了一下书(gene cloning 4ed/T. A. Brown), 顺便看一下大学时写报告参考的BCT网页... 发现BCT网页上的有错哎...*汗* http://juang.bst.ntu.edu.tw/BCT/Chapters/Chap2-1.htm#2.1 这个实验是以 alkaline lysis 的方法进行，其原理是将细菌以 NaOH 及 SDS 分 解，并使蛋白质及 DNA 变性，继之以酸中和。在此情况下，小分子质体 DNA 在 中和後可恢复原态，但大部份的细菌染色体 DNA 则无法完全复原而与 SDS-K+ 所 形成之复合物一起沉淀下，可以离心去除之，上清液中所含的质体则可以酒精或 异丙醇将其沉淀下来。 错的是这一句"小分子质体 DNA 在中和後可恢复原态" 事实上是小分子质体 DNA以supercoiled form型式存在 所以在pH 12-12.5仍不denature 而non-supercoiled form的genome DNA则是在中合後因无法完全的回复 所以东牵西连成一个NETWORK..而生成复合物沉淀 所以重点是"supercoiled form 和non-supercoiled form"是否在pH12-12.5 denatured 还有coDNA ccDNA和 supercoiled应该是不一样的(Topoisomerase 相关) 当然很多时候它们也是混用的 http://www-biology.ucsd.edu/classes/bimm100.FA00/07.ProkChrom.html 1. Common Examples in double-stranded DNA (dsDNA): Linear: break in backbone of both strands, opposite each other or close If close, then have short region of single-stranded DNA (ssDNA) Open circular: break in one strand, other strand is closed circular ... ocDNA Closed circular: both strands are closed, no breaks also called Covalently Closed Circular DNA (cccDNA or ccDNA) Supercoiled DNA: ... [Brown, Fig 6.11] covalently closed circular DNA contains helical structure IN ADDITION to the Watson-Crick double helical structure ... 作者 [email protected] (Schmalcel), 看板 Biology 标题 Re: [问题]关於抽质体DNA的问题 时间 成大生物飞翔站 (Thu Feb 19 09:53:12 2004) 转信 ptt!ctu-reader!ctu-peer!ctu-gate!news.nctu!news2.ncku!ccnews.ncku!flig ─────────────────────────────────────── http://lsvl.la.asu.edu/resources/mamajis/alkaline/alkaline.html 更有兴趣的话: Birnboim HC, Doly J (1979) A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Red. Nov 24;7(6):1513-23 Ish-Homowicz D, Burke JF (1981) Rapid and efficient cosmid cloning. Nucleic Acids Res. July 10;9(13):2989-98 作者 Lipaty ( ) 看板 Biology 标题 Re: [问题]关於抽质体DNA的问题 时间 Thu Feb 19 15:24:34 2004 ─────────────────────────────────────── DNA 和 protein 因为denature之後相互缠绕形成一个大型的分子 这个分子需要较多的水合(solvolysis)才能溶解 但是因为solution III加入以後发生中和 所以盐度升高 这些盐包括solution II里的SDS 和sodium 当然还有solution III里头的potassium 和acetate 我要强调salt也是会溶解的 真正造成沉淀的原因是因为这些盐的浓度升高 把原本应该和DNA-protein水合的 水分子抢走 造成水合不足 所以denature的DNA-protein complex才沉淀 这就是你看到白白的一驼的原因 而plasmid DNA分子比较小 不如chromosome DNA-protein 这个大分子 来的那麽需要水合 所以在这个盐的浓度下 尚可以溶解 作者 Lipaty ( ) 看板 Biology 标题 Re: [问题]关於抽质体DNA的问题 时间 Thu Feb 19 23:25:03 2004 ─────────────────────────────────────── 在高pH值的情况下 管他是不是supercoiled form DNA都会denature 因为高OH-浓度会disturb double strand之间的 hydrogen bonding 在这个前提之下 没有所谓supercoiled form DNA不会denature的道理 全部都会denature 跟结构严不严谨毫无关系 你顶多只能说supercoiled form DNA"比较"不容易denature 但那是在温和的条件之下 高pH值一点都不温和 必须强调沉淀是因为salting out 而不是因为形成complex 再说的更多一些 最後要沉淀plasmid不是也会加salt吗? 可是plasmid没有跟SDS-K形成complex阿 他还是沉淀了 以上说明了沉不沉淀是跟你用多少salt去破坏solvolysis 而不是complex是否形成在决定的 supercoil form一样会denature uncut的plasmid会有三个major band对吧? 其中只有一个是supercoil form的plasmid 另外两个band都不是supercoiled form plasmid的 所以并不是只有supercoiled form才会被纯化出来 -- 『要用轻盈的脚步，跨过生命中沉重的事！』 --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.25.191 ※ 编辑: enisx 来自: 140.112.25.191 (02/20 18:26) ※ 编辑: enisx 来自: 140.112.25.191 (02/21 12:15)